조직 절편에서 대량 장기까지 원격 스캐닝을 위한 멀티코어 섬유 다발을 사용한 다중 모드 비선형 내시경 검사의 타당성 연구

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 13779(2023) 이 기사 인용

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여기에서는 Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, Second Harmonic Generation 및 Two-Photon Excited Fluorescent의 라벨 없는 방식을 결합한 다중 모드 비선형 이미징을 위한 소형 멀티 코어 광섬유 프로브의 개발 및 적용에 대해 보고합니다. 이 멀티 코어 섬유 설계의 프로브는 말단 끝에서 움직이는 부분과 전압이 전달되는 부분을 방지하므로 경쟁 구현에 비해 임상 요구 사항에 대한 호환성이 향상될 것으로 예상됩니다. 프로브의 성능 특성은 생체 외 벌크 인간 및 돼지 내장 조직을 사용하여 임상적으로 관련된 샘플에 대한 적용 가능성을 평가하기 전에 얇은 극저온 섹션 및 인공 표적을 사용하여 확립됩니다. 데이터의 본질적인 픽셀화 특성을 상쇄하기 위해 이미지를 재구성한 후, 기록된 이미지는 표준 현미경 대물렌즈를 사용하여 레이저 스캐닝 현미경으로 얻은 다중 모드 비선형 이미지에 비해 조직 수준에서 높은 이미지 품질과 형태화학적 적합성을 보여줍니다. 또한 간단하면서도 효과적인 재구성 절차가 제시되고 만족스러운 결과를 얻을 수 있음이 입증되었습니다. 마지막으로, 다중 모드 섬유 프로브를 실제 임상 평가 및 적용으로 전환하기 위한 추가 개발을 위한 명확한 경로가 설명되어 있습니다.

형태학적 및 화학적 정보를 모두 제공하는 조직의 라벨 없는 생체 내 이미징은 많은 구상된 의료 응용 분야, 특히 조직의 수술 중 비침습적 조직병리학적 검사에 매우 중요합니다. 지난 몇 년 동안 다중 모드 이미징 접근 방식에서 다양한 분광 기술을 결합하는 것이 속도, 침투 깊이 및 분자 특이성에 대한 모든 요구 사항을 충족하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다1,2,3. 그러한 접근법 중 하나는 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) 현미경 검사법으로, 단일 이미징 장치에서 다른 두 가지 비선형 효과인 TPEF(2광자 여기 형광)와 SHG(2차 고조파 발생)를 동시에 생성합니다. CARS는 특정 분자 진동을 매핑할 수 있으며, 가장 자주 선택된 진동은 주로 지질(예: ~ 2855 cm−1, νs(CH2)) 또는 단백질(예: ~ 2930, νs(CH3))을 나타냅니다. 생물학적 샘플이 풍부합니다. 대조적으로, TPEF는 세포 대사에 대한 중요성으로 인해 조직에 어디에나 존재하는 내인성 자가형광단, 특히 NAD(P)H를 해결하는 데 사용될 수 있습니다. 또한 SHG는 중심대칭이 아닌 물질에서만 발생하는 과정으로 콜라겐 섬유나 미오신 필라멘트와 같은 준결정성 생체 물질에 매우 특이적으로 작용합니다. 따라서 이러한 세 가지 비선형 양식을 결합하면 라벨이 없는 방식으로 조직의 형태화학에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

이러한 맥락에서 우리는 CARS, SHG 및 TPEF를 결합한 다중 모드 비선형 현미경 검사법이 광범위한 질병, 특히 암의 특징적인 구조와 그에 수반되는 분자 변화를 검출할 수 있음을 입증했습니다4,5. CARS/SHG/TPEF 이미지 데이터 해석을 용이하게 하기 위해 고급 이미지 처리 알고리즘은 자동으로 특성 속성을 추출할 수 있습니다. 또한 자동 평가와 함께 이러한 라벨 없이 기록된 다중 모드 이미지에 인코딩된 정보는 다변량 통계를 통해 계산 헤마톡실린 및 에오신(H&E)8 이미지로 변환될 수 있음을 보여줄 수 있습니다. 의료 전문가에 대한 지식과 훈련을 받았지만 과도기적 수용에도 도움이 될 수 있습니다. 이러한 전산 H&E 이미지를 생성하고/하거나 추가 임상 의사 결정을 위한 기초로 질병 등급 또는 시각적 분할을 포함한 다중 모드 비선형 영상 데이터의 자동 평가를 현장에서 그리고 수술 중에 직접 제공하기 위해 소형 휴대용 내시경 장치 필수입니다. 수술 상처의 종양 마진 감지부터 중공 기관(예: 염증성 장 질환9)의 증상 조사 및 질병 감지, 분류 및 모니터링에 이르는 응용 시나리오를 통해 비선형 분광 영상을 위한 내시경 장치의 개발이 중요한 관심 대상이 되었습니다. 몇 년 동안. 다양한 접근법이 제시되었습니다: 포인트 스캐닝 프로브10 외에도 가장 일반적인 방법은 스캐닝 섬유 내시경11,12,13,14,15,16,17,18 갈보 스캐닝 거울 또는 미세 전자 기계 시스템(MEMS) 스캐너19,20,21를 사용하는 것입니다. 22,23,24.

90%) in the wavelength range of 400–780 nm. The GRIN lense and DOE assembly was manufactured to stricter tolerances, minimizing vignetting and chromatic errors of the pump and Stokes beams. Additionally, the probe head was refined with a new metal housing to protect and enforce the otherwise fragile fiber connection. For the same reason, Medical Device Regulation (MDR) approved endoscope tubes and SMA connectors were applied to the fibers. A home-built LSM has been used for coupling the excitation laser pulses generated by an 80 MHz mode-locked Nd:VAN laser (picoTRAIN, High Q Laser, Austria) in combination with an optical parametric oscillator (Levante Emerald, A.P.E, Germany) at 816 nm (pump) and 1064 nm (Stokes) into the imaging fiber34. This wavelength pair corresponds to a Raman resonance of 2850 cm−1, matching the symmetrical stretching vibration of CH2 groups particularly abundant in lipids, which results in a CARS signal at 661.8 nm. As excitation wavelength for the SHG modality, we used the 1064 nm beam, while both beams served as the excitation source for the TPEF modality. The proximal end of the imaging fiber is placed in the focal plane of the LSM where it is scanned by two galvo mirrors in a dense raster pattern, while the distal end of the probe is placed at the tissue sample. The full image circle diameter measures ~ 460 µm, however, a reduced scanning field (~ 260 µm) in the central region of the imaging fiber is used to avoid damaged cores in the fiber, which might have been caused during the manufacturing process of the probe head. The power of the laser beams at the sample site was about 50 mW for pump and 25 mW for Stokes in the probe measurement and 70 mW for pump, and 40 mW for Stokes in LSM recordings. The average laser power used for nonlinear endoscopic imaging provided sufficient signal generation from the presented samples without causing visible damage to any of them and aligns with the power scales utilized in comparable nonlinear endoscopic imaging applications18,35 with use of picosecond laser pulses. A useful point of reference in this context is provided by Galli et al.36 who investigated photodamage under similar excitation conditions as a function of recorded frame repetitions. A schematic setup of the LSM coupled to the probe is depicted in Fig. 1a. Figure 1b shows the internal optical design of the probe head. Two notch dichroic beamsplitters (NFD01-532 (Semrock, USA) and F73-067 (Chroma, USA)), and three bandpass filters (FF01-661/20 (Semrock, USA), FL532-10 (Thorlabs, USA) and FF01-550/88 (Semrock, USA)) were used in addition to a short-pass filter (FESH0700, Thorlabs, USA) to separate sample signals. In the current design iteration, all optics are designed for a measurement through 170 µm of glass. For easier prototyping and more versatility in the testing phase, the current design does not include a fixed glass window and instead relies on a cover glass to be placed on the sample. The probe design is largely agnostic to the specific LSM used and could, for example, be coupled with a compact fiber-based laser system and scan head to be incorporated into a mobile station, as demonstrated recently for a rigid-body nonlinear endoscope35. An overview of key structural and performance characteristics of the probe is given in Table 1./p>

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